提高蛋白质热稳定性预测的准确性

我们与段建新博士进行了深入交流，探讨了他的论文《提高单点突变蛋白质热稳定性预测的准确性》，该论文近期发表于《生物物理学杂志》。

请告诉我们，开展这项研究的主要动机是什么？

蛋白质的功能与其结构和动态行为密切相关。因此，了解蛋白质的热稳定性可以为理解其工作原理提供基础性见解。例如，单点错义突变可能会直接影响蛋白质功能，从而导致疾病。研究发现，其中许多突变与蛋白质的热稳定性有关。 此外，从实际应用的角度来看，蛋白质稳定性工程在各行各业都有广泛的应用，例如，疫苗和抗体需要经过工程改造以延长保质期并防止聚集；用于食品、洗涤剂、造纸或燃料领域的工业酶，则需要设计成在目标环境中保持稳定并发挥功能。

如您所知，我们在利用FEP+ 技术推进小分子药物发现方面取得了巨大成功——我们已发表了多篇论文，且与传统方法相比，我们所有的药物发现项目都以更快的速度达成了各项里程碑。但目前尚不明确的是，FEP+ 在推进生物制剂相关项目方面能发挥多大作用，因此我们着手设计了一项研究，专门考察FEP+ 在预测蛋白质热稳定性方面的表现。 我们的目标是定量和定性地评估该技术，以确定其能否作为预测突变后蛋白质热稳定性变化的可行方案，从而为蛋白质工程 项目提供指导。

此前是否有研究曾将FEP应用于蛋白质？如果有，本研究与之有何不同？

将自由能平移（自由能微扰 ，FEP）理论应用于预测单点突变对蛋白质稳定性的影响这一思路并非新鲜事；然而，由于存在若干严重局限性，此前尚无法在工业环境中进行生产级别的计算来预测蛋白质稳定性，这些局限性包括：无法对涉及脯氨酸的突变（无论是突变为脯氨酸还是从脯氨酸突变）进行建模——此类突变会改变主链的键合拓扑结构——以及建模电荷改变突变的复杂性。 在本研究中，我们扩展了FEP+ 协议，以准确建模这两种类型的突变。此外，由于FEP计算可能非常耗费计算资源，许多早期研究仅限于进行非常短的模拟，且突变周围的溶剂化范围有限，最终导致预测精度较低。得益于算法的改进和GPU硬件的进步，Schrödinger的FEP+ 已多次证明，它能够在现实的时间范围内对项目产生实质性影响。

由于我们旨在专门评估FEP+在处理具有挑战性的脯氨酸和电荷改变突变时的表现，因此在选择测试系统时格外谨慎，以便能够定量评估我们的结果——我们整理了一套数据集，其中包含野生型和突变体的高分辨率晶体结构，以及经过精确测量的稳定性数据。 您可以在论文中查阅我们测试系统的详细信息。我很高兴地报告，我们在预测稳定性变化方面达到了与先前无数小分子研究中观察到的结果相当的准确度，这证明FEP+ 确实是研究生物制剂的一种合适的计算策略。

还有其他预测蛋白质热稳定性的方法吗？如果有，与本研究中FEP+ 的结果相比如何？

是的，由于准确预测蛋白质稳定性至关重要，多年来已提出了许多不同的方法。我们将FEP+ 的预测结果与几种较常用的方法进行了比较。

如您所见，FEP+ 在定量指标上表现优于所有其他常见方法，唯一可能的例外是MUPRO——这是一种仅使用序列信息并将所有突变纳入训练集的机器学习（ML） 模型。然而，有研究指出MUPRO可能存在训练集偏差，而当您查看表格中给出的准确率、敏感度和特异性 等定性指标时，这一问题确实得到了印证。

让我通过一个例子来解释这三项措施的含义：

• 如果实验发现，100个突变中有90个会导致不稳定，而有人盲目地猜测所有突变都会导致不稳定，
  • 那么，这种猜测的准确率将达到90%，
  • 但在“敏感度”指标上得分将仅为0%，该指标用于衡量正确识别稳定突变的能力，
  • 而在特异性 测试中，其正确识别致不稳定突变的能力达到了100%。

要想获得一个真正实用的分类工具，你需要一种在所有三个指标上都能保持高分的方法，例如FEP+ ，该方法的表现明显优于其他所有方法，包括 MUPRO。尽管 MUPRO 在特异性 上的得分不错，但这主要是由于其训练集的影响；然而，正因其受该训练集的偏倚，它对稳定突变的预测效果较差，这从其仅为 0.32 的极低敏感度得分中即可看出。

但FEP+ 的计算成本难道不高吗？它在规模化部署时能发挥多大作用，从而切实加速发现计划的推进？

诚然，FEP+ 研究需要投入计算资源，但得益于软件算法的改进以及GPU硬件处理能力的不断提升，使用FEP+ 进行全面分析对于实际项目而言已完全可行。 此外，正如我们在论文中所描述的，我们设计了一套筛选 分析流程：利用BioLuminate应用程序中计算效率显著更高的残基扫描功能（该功能倾向于产生更多假阳性结果）作为过滤器，为后续的FEP+ 分析做准备。通过这种方式，可以快速筛选出所有相关突变，仅将经确认具有稳定化作用的突变传递至FEP+ 进行分析，并让FEP+ 识别出最有可能为真阳性的突变。

这听起来都很令人期待，未来是否有计划对这项技术进行改进或扩展？

是的，当然，我们从这项研究中获益良多，例如如何最好地建模该蛋白质的展开状态，以提高对稳定性变化的预测精度。我们还仔细审查了研究结果，并识别出一些可能需要更长时间模拟才能充分捕捉到较大结构变化的情况。我们将继续优化实验方案，以提升预测吞吐量和精度的双重表现。