JUN 12, 2025

標的遺伝子の抑制を目的とした、新規転写因子の計算機支援設計

要旨：

DNA結合タンパク質（DBP）は、天然および合成の両方の文脈において、遺伝子の制御や操作に重要な役割を果たしています。機械学習やタンパク質工学の進歩により、現在ではデ・ノボDBPの設計が可能となっています。初期の試みでは、配列特異的なDNA結合が可能な小型の単鎖タンパク質が得られましたが、これらの単量体では遺伝子発現を変化させることはできませんでした。 対照的に、多くの天然の転写因子（TF）はホモ二量体であり、デ・ノボDBPよりも多くのタンパク質-DNA接触を可能にしている。 我々は、これらのTFの二量体構造がDNA結合親和性を高め、天然の転写機構が存在する場合でもTFがDNAに結合し続けることを保証するという仮説を立てた。これを検証するため、細菌において測定可能な遺伝子抑制を達成することを目標に、構造 に基づくアプローチを用いて、デ・ノボのホモ二量体TFを計算機上で設計した。 RFdiffusionを用いてホモ二量体転写因子の骨格を設計し、その後ProteinMPNNを用いてアミノ酸配列を当てはめた。予測された配列はAlphaFold2でフォールディングされ、RFdiffusionによる設計とのアラインメントにおける予測局所距離差検定（pLDDT）、予測アラインメント誤差（PAE）、およびCα原子の二乗平均平方根距離（RMSD）に基づいて、上位96個の転写因子が選定された。 選定されたTFを大腸菌で発現させ、蛍光アッセイを用いてその抑制効果を測定した。6つのTFが4倍以上の抑制効果を示し、最も性能の高いTFでは20倍近い抑制効果が得られた。すべてのTFがかなりの直交性を示し、CRISPR干渉システムに匹敵する抑制倍率を達成したことから、効果的なデ・ノボホモ二量体TFの設計が実際に可能であることが実証された。 将来的には、DNAを屈曲させる転写因子や、2つ以上のサブユニットから構成されるより大きな転写因子オリゴマーを設計することで、新規転写因子の抑制効果をさらに高めることができる可能性がある。設計に成功した転写因子は、合成遺伝子回路、様々な細胞プロセスを検出するバイオセンサー、および遺伝性疾患に対する堅牢な治療法への応用が期待される。