サーモサイエンティフィックのクライオEMおよびSchrödinger プラットフォームを用いた、遺伝子から医薬品への迅速な開発アプローチ

はじめに

構造- 構造に基づく創薬（SBDD）は、ターゲット を基盤とする低分子^創薬に、費用対効果、迅速性、および優れた特性を付与^する1-3。今日、計算機を用いたアプローチは、リガンド ^{の親和性4および選択性5を}定量的に予測できる段階にまで進化している。 歴史的に、X線結晶構造解析はSBDDの取り組みを牽引し、^{エイズ⁶やがん²}を含む様々な疾患の治療に向けた、強力かつ選択性の高いプロテアーゼおよびキナーゼ阻害剤の開発につながってきた。しかし、巨大な高分子複合体や膜タンパク質など、医薬的に重要な多くの創薬ターゲットは、3次元構造情報が不足しているため、SBDDへの適応が困難である。 タンパク質生産および低温電子顕微鏡法（cryo-EM）における最近の進歩により、これらの重要な^標的に対するSBDDの役割が拡大している^⁷,⁸。本稿では、Thermo Fisher ScientificおよびSchrödinger の研究チームが採用したアプローチを紹介する。同チームは、GeneArt Gene-to-Protein、Thermo Scientific iSPAワークフロー、およびSchrödinger 創薬プラットフォームを活用している。

ターゲット 選択

創薬プログラムを開始するためのターゲットの選定は、アンメット・メディカル・ニーズの理解と、治療の可能性を示す臨床研究、遺伝学的研究、前臨床研究からの複数の証拠に基づいて行われます（図1）。ターゲット の活性調節と病態生理および疾患メカニズムを結びつける生化学的、薬理学的、遺伝学的データという形の生物学的根拠が、重要な要素となります。 例えば、前臨床モデルやヒト研究において、遺伝子型と表現型の関係が明確に定義されている標的は、優先度が高いとみなされる。阻害または活性化による影響の確認や、治療可能性の理解もまた、ターゲット の妥当性検証における重要な側面であり、これらはプログラム開始の契機となる。

SBDDの対象となる標的はすべて、モデリングが可能でなければなりません。特定のターゲット について、現在の臨床および前臨床プログラムを慎重に検討した後、 Schrödingerの計算プラットフォームによって解決可能な課題が特定されます。 Schrödinger プラットフォームを用いて、タンパク質の構造 の品質および結合部位のドラッグアビリティを分析し、続いて当該技術での利用に適した構造であるかどうかの評価を行います。 高品質な構造データが不足しているため、生物学的根拠や治療的勢いの基準を満たす非常に興味深い標的の多くは、高分解能の構造データが得られるまで優先順位を見直す必要があります。これは、こうした標的が膜タンパク質であるか、X線結晶構造解析が困難な大規模な多量体構造を形成するタンパク質であることが多いことが原因です。 幸いなことに、こうしたタイプの標的は、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）による構造決定に非常に適していることが多く、これまで構造決定が不可能だった標的のモデリングも可能にします。生物学的根拠、未充足医療ニーズ、およびクライオ電子顕微鏡による構造決定の可能性を慎重に分析した結果、ターゲット が共同研究の対象として選定されました。イネーブルメント ターゲット

タンパク質の生産

ターゲット が選定された後、最初に乗り越えるべき課題は、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）での使用に適した品質のタンパク質を生産することです。 クライオ電子顕微鏡（Cryo-EM）は通常、分子量が50 kDaを超える多量体および／または膜タンパク質複合体に適用されます。これは、特に創薬における期待されるタイムラインの範囲内で、タンパク質の生産と精製において課題をもたらします。サーモフィッシャー社のGeneArtプラットフォームは、「Gene-to-Protein」サービスを含んでおり、タンパク質配列のみを指定すれば、遺伝子合成からタンパク質精製までのすべての工程をカバーします（図2）。

本プロジェクトでは、遺伝子の最適化、DNA合成、およびGibco Expi293細胞を用いた一過性タンパク質発現が行われました。末端Hisタグを介して細胞質画分から精製した結果、純度が高く、それ以上の精製を必要としないタンパク質が得られました。遺伝子配列から精製タンパク質に至るまでの全ワークフローは、6週間以内に完了しました。 得られたタンパク質の濃度は5mg/mlであり、その後の解析に必要な多数の粒子を含む高密度の顕微鏡写真を撮影するのに十分な量であった。また、収量は10mgを超え、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）を用いた構造 測定パイプラインに数ヶ月分以上のタンパク質を供給するのに十分な量であった。

低温電子顕微鏡法による構造 の構造決定

選定したターゲット の構造 測定には、創薬向けの市販単一粒子解析（SPA）ソリューションであるThermo Scientific iSPA Workflowを採用した。これには、ガラス化クライオ電子顕微鏡試料の調製用デバイスであるThermo Scientific Vitrobot Mark IVが含まれており、タンパク質溶液の塗布およびブロッティング後、液体エタン中でホーリーカーボングリッドを迅速にプランジ冷凍することを可能にする。 これにより、タンパク質を非結晶性の氷の薄層に包埋し、溶液中の天然状態を保持することが可能となる。その後、試料はThermo Scientific Krios RxクライオTEMを用いてクライオEMデータ収集が行われる。Krios Rxは、Thermo Scientific EPUで操作される。EPUはデータ取得ソフトウェアであり、最近のEPU Multigrid機能により、複数のグリッドにわたる自動スクリーニングとデータ収集を可能にする。 Krios Rxは、対象となるターゲット の2次元投影画像を表す動画を記録し、これらはその後、計算機による3次元画像再構成に利用されます。データ収集後、3次元再構成では、単離された粒子の数十万枚に及ぶ2次元画像の位置合わせと平均化を行い、タンパク質の高解像度マップを算出します。EPU Quality MonitorおよびEPU Data Management（Thermo Scientific Athena Softwareを搭載）により、最適なデータ品質とデータフローが確保されます。

本研究では、iSPAワークフローにより、リガンド非結合複合体およびリガンド結合複合体の両方について、約2.5 Åの分解能を持つ再構成構造を容易に得ることができた（図3）。このターゲット の初期構造解析（イネーブルメント ）には、タンパク質の受領から2週間を要し、2回のイメージング試行が行われた。最初の試行では、タンパク質を0.5 mg/mlの濃度で凍結したが、成功しなかった。 クライオ電子顕微鏡によるスクリーニングの結果、粒子の分布は不均一であり、炭素領域上または炭素フィルムの穴の縁付近にのみ粒子が確認された。一般的に、粒子密度が高いほどガラス化には有利であるため、GeneArt社はより高濃度（5 mg/ml）のタンパク質を2回目のバッチとして提供し、その結果、グリッド上で均一かつ高密度な「単層」状の粒子分布が得られた。 対象化合物はDMSOに溶解し、ガラス化処理前にタンパク質溶液に添加した。これにより、最終的な化合物 およびDMSOの濃度をそれぞれ約50 μMおよび約0.5%とすることを目指した。 各データセットについて、約5,000本の動画を収集し、低コストのクアッドGPUワークステーション上で^{動作するRelion 39を用いて}再構成を行った。サンプル調製から最初の複合体の高解像度再構成構造 までの所要時間は合計で3日以内であり、同様の時間枠内で追加のリガンド結合構造の解明も可能であった。

図3。左は、Thermo Scientific社のKrios Rx Cryo-TEMハイエンド顕微鏡である。これは、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）を用いたSBDD（構造に基づく薬物設計）向けの初の製薬業界専用ソリューションであり、反復的な構造 の決定に最適な高スループットが保証されている。右は、代表的な4つの残基 の詳細図であり、EMデータ収集から再構築されたクーロンポテンシャルと、それに適合させたモデルが示されている。図からわかるように、データはほとんどの側鎖の位置を特定するのに十分なものであった。

 

構造-に基づく創薬

タンパク質-リガンド 複合体の構造が得られた後、Schrödinger プラットフォームを用いて原子モデルを作成し、Schrödinger のSBDDパイプラインに投入した。このプロセスの一環として、分子力学に基づくドッキングと実空間の相互相関を組み合わせて、リガンドをクライオ^EMマップ上に配置するツールであるGlideEMを用いてリガンドを配置した10。 得られた原子モデルは、Phenix/OPLS3e（OPLS4の旧バージョン）を用いて精製された。このツールは、最先端の実空間精製技術と、タンパク質-リガンド 系の基礎となる物理的挙動を捉えることができる高度なSchrödinger 力場および暗黙的溶媒モデルを組み合わせたものである。このワークフローにより、クライオEMデータと系の物理的挙動の両方に整合した、堅牢な原子モデルを迅速に作成することができる。

これらの原子モデルは、Schrödinger のSBDDパイプライン内で活用され、多種多様な化合物を膨大な数にわたり仮想スクリーニングすることが可能となります。さらに、既知の欠点を排除したり、競合他社の化合物との差別化を図る機会を最大限に活用したりするための、ターゲットを絞った計算スクリーニングを設計することも可能です。本事例では、改良された原子モデルを用いて FEP+ 、親和性予測モデルを構築し、過去に特許を取得した62種類の化合物 同族系列について、親和性の差異を遡及的に予測することでその妥当性を検証しました。その結果、いくつかの主要な親和性クリフを捕捉することができ、精緻化された原子モデルが、SBDD主導のプログラムの一環として将来的な設計に活用できるほど十分に高品質であることを実証しました（図4）。 この検証済みの親和性モデルを用いて、化合物の修飾を検討し、プロジェクトチームが特定したターゲット の製品プロファイル目標（新規性、透過性の向上、反応性のあるグループ の除去など）に対応すると同時に、活性 を維持した。Pathfinderを用いて有望な化合物を考案し、 Glide を用いて潜在的な分子姿勢を生成し、 FEP+ 検証済みの親和性モデルを用いて、活性 のスコア付けを行いました。ターゲット とリガンド の複合体のクライオ電子顕微鏡画像構造 を取得してから数週間以内に、構造 を基盤とした計算手法を用いて、合成対象となる化合物の優先順位付けを行いました。

結論

Thermo Fisher社の「GeneArt Gene-to-Protein」、Thermo Scientific社の「iSPA Workflow」（Thermo Scientific Cryo-EM）、およびSchrödinger 社の創薬プラットフォームのソリューションを組み合わせて活用することで、研究チームは2ヶ月以内に創薬候補化合物ターゲット の構造解明イネーブルメント を促進し、そのわずか数週間後には、計算機設計による新規化合物を導き出すことに成功しました（図5）。 これは、クライオ電子顕微鏡法と計算化学的手法を組み合わせることで、創薬プロジェクトに大きな影響を与える可能性のあるパイプラインを構築できることを明確に示している。